Diagnostika COVID-19 – súčasnosť a možný vývoj

 

Ing. Jarmila Lakomá, Ph.D., MPM

Medical Science Liaison pre Českú republiku

Scientific Engagement & Communication Lead CE cluster

Pandémia menom COVID-19 sa rozšírila svetom v priebehu dvoch krátkych mesiacov. Jej stopa však ostane v ľudskej spoločnosti už navždy. Otázkou ostáva, čo ostane, ako „bolo predtým“ a čo sa nenávratne zmení? A čo ak prídu ďalšie podobné epidémie alebo pandémie ? Rýchla identifikácia a izolácia infikovaných jedincov je označená ako kľúčový mechanizmus kontroly šírenia vírusu SARS-CoV-2. Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) hodnotí dve základné metódy diagnostiky vírusu SARS-CoV-2: 1. laboratórne testovanie založené na molekulárno-biologickej metóde rRT-PCR, 2. laboratórne testovanie pomocou tzv. „rýchlotestov“. Identifikácia symptómov ako horúčka, kašeľ, slabosť, ťažkosti s dýchaním (a ev. ďalšie menej typické príznaky) a röntgenové vyšetrenie pľúc sú nešpecifickým indikátorom infekčnosti SARS-CoV-2, ktorá si vyžaduje ďalšie epidemiologické dáta. Aké sú súčasné možnosti testovania? Aký je ich princíp, cena a čas, za aký je výsledok? O čom presne hovoria pojmy senzitivita a špecifickosť („špecificita“)? Zlatým štandardom pre diagnostiku COVID-19 ochorenia je rRT-PCR (real time reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia), ktorá využíva vzorky z horných dýchacích ciest, slín, krvného séra alebo stolice. Tento typ priamej diagnostiky sa opiera o preukázanie prítomnosti vírusového infekčného agensa použitím nukleovej kyseliny (SARS-CoV-2 je RNA vírus, teda kyseliny ribonukleovej (RNA)). Metóda PCR je charakteristická vysokou špecifickosťou (schopnosť presne identifikovať jedincov bez ochorenia, t. j. stanovenie negatívneho prípadu) a senzitivitou (schopnosť presne identifikovať ochorenie, t. j. stanovenie pozitívneho prípadu). Má však tiež svoje obmedzenia, ktoré spočívajú v možnosti falošnej negativity (prípad, keď síce výsledok testu hodnotí pacienta ako bez ochorenia, avšak v skutočnosti tento pacient chorý je). K tomuto môže dôjsť napr. v prípade asymptomatickej vírusovej infekcie. Preto je veľmi dôležité správne načasovanie odberu vzoriek (nosohltanových sterov). Množstvo vírusu sa v priebehu infekcie u jedinca mení. Citlivosť PCR testu je najvyššia na počiatku prejavu symptómov. Naopak, pacienti, ktorí sú síce infikovaní, ale sú asymptomatickí, môžu mať falošne negatívne výsledky testu. Rovnako je to u pacientov, ktorým symptómy ustupujú. Výsledok priamej detekčnej metódy je dostupný v časovom horizonte 1 až 4 dni (v závislosti od laboratória). Použitie tzv. „rýchlotestov“, alebo „rapid diagnostic tests – (RDT)“ sa považuje za nepriamu diagnostickú metódu. RDT testy sú vyvinuté na rýchle testovanie pacienta. WHO neodporúča tento typ testovania na preukázanie klinickej diagnózy COVID-19. Naopak, WHO odporúča použitie RDT v laboratórnych podmienkach pre ďalší vývoj a testovanie spektra ich použiteľnosti.¹ Aktuálne sú na trhu dva typy RDT testov – rýchle testy detekcie antigénu (existuje asi 10 typov testov, v EÚ sú zatiaľ dostupné len tri) a rýchle protilátkové testy (vyše 60 certifikovaných testov na trhu). Princíp testovania protilátkových rýchlotestov je založený na detekcii špecifických protilátok vznikajúcich imunitnou odpoveďou organizmu na infekciu v krvi pacienta. Mechanizmus testovania je založený na tzv. „lateral flow“ imunochromatografickom princípe. Ide o dnes už bežný typ imunodiagnostickej metódy, ktorý sa vyznačuje rýchlosťou a relatívne vysokou spoľahlivosťou (niektoré testy uvádzajú spoľahlivosť až 97,5 %). Tento typ testovania má svoje opodstatnenie, ak napr. infekt ustúpil z dýchacích ciest, alebo v prípade asymptomatického klinického prejavu pacienta. Všeobecne organizmus napadnutý vírusovou infekciou odpovedá najprv nešpecifickou a následne špecifickou imunitnou reakciou. Prvé sa v rámci imunitnej odpovede organizmu tvoria IgM (imunoglobulín M) protilátky (skríning akútnej infekcie). Ich detekcia v organizme je krátkodobá (7 až 10 dní od počiatku infekcie) v porovnaní s neskôr nastupujúcimi IgG (imunoglobulín G) protilátkami (testovanie protektívnej imunity). IgG protilátky sa objavujú okolo 14. dňa od počiatku infekcie a vrchol koncentrácie dosahujú medzi 4. až 6. týždňom. Perzistencia IgM v organizme je kratšia (3 – 6 mesiacov) v porovnaní s IgG, ktoré pretrvávajú v organizme niekedy aj celý život (graf 1). Možnosť molekulárno-biologického laboratórneho vyšetrenia na vírus SARS-CoV-2 je pre lekárom indikovaných pacientov v Českej republike, ako aj na Slovensku hradená zdravotným poistením. Pre počiatočný nedostatok testovacích kitov (súprav) bolo obmedzenie použitia testov len pre tento typ pacientov. V súčasnosti je možné zažiadať o test aj ako samoplatca. Aj súkromné laboratóriá v oboch krajinách zo začiatku čelili obrovskému náporu žiadostí. Ceny sa na Slovensku pohybujú v rozmedzí 30 – 70 Eur plus manipulačný poplatok. V Českej republike je poplatok za vyšetrenie pre samoplatcov orientačne okolo 3-tisíc CZK. Tieto ceny závisia od odberového miesta a laboratória. Na stránkach ministerstiev zdravotníctva ČR a SR sú odkazy na zoznamy odberových centier s možnosťou testovania.^3,4 Okrem centrálnych odberových centier zoznamy obsahujú aj centrá pre samoplatcov a tzv. „drive-in“, alebo „drive-thru“ odberové miesta, kde odbery realizujú pacientovi priamo z auta. Rovnako siete súkromných laboratórií na svojich webových stránkach disponujú konkrétnym zoznamom odberových miest a informáciami pre odber vzoriek. Cenové relácie laboratórnych testov na protilátky (samostatne IgG alebo IgM a IgG v kombinácii) pre samoplatcov sa na Slovensku pohybujú v rozmedzí od 40 – 70 Eur/test v závislosti od vybraného pracoviska (nákup RDT testov sa pohybuje orientačne medzi 140 až 400 Eur/balenie, ktoré obsahuje 10 alebo 25 testov). Konkrétny typ testu (teda či sa jedná o RDT testovanie, alebo použitím laboratórnych prístrojov) je na rozhodnutí daného pracoviska. Výsledky testovania pomocou laboratórnych prístrojov však trvajú dlhšie (cca 2-4 dni) v porovnaní s RDT testami. V Českej republike sú ceny testovania pre samoplatcov v závislosti na konkrétnej metóde testu. V prípade laboratórneho testovania sa ceny pohybujú v rozmedzí 600 – 1 500 CZK/test. V prípade RDT testov na IgG a IgM v kombinácii stojí vyšetrenie približne 500 CZK/test a pre samotné IgG približne 600 CZK/test. Je však potrebné upozorniť, že tieto RDT testy nie sú určené pre samotestovanie laickej verejnosti. Na stránkach ŠÚKL je uvedené: „Na trhu v Európskej únii momentálne nie sú registrované žiadne testy na COVID-19 určené na samotestovanie laickej verejnosti. Rýchlotesty, ktoré sú v EÚ registrované, sú určené na profesionálne použitie. V prípade ich použitia laickou verejnosťou hrozí riziko nesprávneho použitia testu a tiež nesprávnej interpretácie výsledku“.⁵ Dôkaz negatívneho testu na ochorenie COVID-19 – v súčasnosti priepustka cez hranice, v blízkej budúcnosti možno podmienka vstupu do reštaurácie či do kina? V závislosti od typu RDT diagnostického testu (napr. tehotenský test, test na Helicobacter pylori a iné) je čas čakania na výsledok zvyčajne otázkou minút. Časová dostupnosť výsledkov rýchlotestov na COVID-19 je okolo 10 – 20 minút. V prípade COVID-19 sa rýchlotesty líšia svojou špecifickosťou a senzitivitou. Hlavným otáznikom pri tejto nepriamej diagnostickej metóde je kontrola nízkeho počtu falošne pozitívnych a falošne negatívnych výsledkov. Zo správnej interpretácie rýchlotestov vyplýva, že populácia pozitívna na IgG protilátky (IgG+) v prípade odznenia symptómov a negatívneho výsledku PCR je tá časť populácie, ktorá bola infikovaná SARS-CoV-2 vírusom a túto infekciu prekonala a získala protilátky pre prípad opakovanej infekcie (obr. 1). Obr. 1: Interpretácia diagnostického rýchlotestu na SARS-CoV-2   Adaptované z https://www.clinisciences.com/a https://olup-prednahora.sk/aktuality/blog/laboratorne-testovanie-covid-19-co-nam-prezradia-testy/ ^6,7 Naopak, veľmi rizikoví pri stretnutí s prenášačom sú pacienti, ktorí v týchto testoch preukázali neprítomnosť oboch typov protilátok (IgM-/IgG-). V tomto prípade treba vziať do úvahy vek a celkový zdravotný stav tohto rizikového jedinca. Tab. 1: Klinický význam výsledkov kombinácie testov rRT-PCR a sérologických testov na protilátky IgM a IgG

Preložené a dostupné na internete http://www.diazyme.com/covid-19-antibody-tests²

Odborníci odporúčajú kombinovať priamu a nepriamu metódu detekcie vždy s ohľadom na konkrétneho pacienta (tab. 1), (obr. 2).

Obr. 2: Schéma kombinovaného použitia jednotlivých testov vo vzťahu k množstvu vírusu v organizme

Samotestovanie v pohodlí domova alebo realita zo StarTreku? Telemedicína sa stáva štandardnou metódou pre niektoré špecializácie ako dermatológia, psychiatria a psychológia, praktické lekárstvo. Ešte prednedávnom neznámy pojem elektronické recepty je dnes bežne znejúcou esemeskou v našich telefónoch. Možno je len otázkou času, kedy si zvykneme napríklad na „inteligentnú toaletu“ (obr. 3), tak ako sme si zvykli na inteligentný telefón.

Obr. 3: Inteligentná toaleta : Inteligentná toaleta automaticky odosiela údaje extrahované z ľubovoľnej vzorky biolo-gického materiálu. Je vybavená technológiou, ktorá dokáže diagnostikovať celý rad onkomarkerov v stolici a moči (napr. kolorektálny karcinóm).

  Dostupné na internete https://med.stanford.edu/news/all-news/2020/04/smart-toilet-monitors-for-signs-of-disease.html⁹ Spoločnosť SANOFI v spolupráci so start-up spoločnosťou z Kalifornie Luminostics¹⁰ prichádza s absolútne originálnym nápadom pre samotestovanie ochorenia COVID-19 v pohodlí domova. Sanofi poskytne dlhoročnú skúsenosť v oblasti klinických štúdií a Luminostics svoju patentovanú technológiu „glow-in-the-dark“ nanočastíc (žiara v tme) vyvinutých pre spotrebiteľskú diagnostiku. Princíp stanovenia by sa dal v počiatočnom kroku prirovnať k už spomínaným RDT testom. Avšak v tomto prípade ide o kombináciu unikátneho vysoko citlivého typu nanočastíc a patentovaného hardvéru a softvéru spoločnosti Luminostics. Tieto nanočastice sú spolu s ďalšími reagenciami súčasťou nosnej platničky jednorazovej náplne (obr. 4). Obr. 4: Samotestovacie zariadenie Luminostics¹⁰ 1. Opakovateľne použiteľný adaptér na mobilný telefón. Tento adaptér je kompatibilný s väčšinou telefónnych zariadení 2. Jednorazová náplň do adaptéra. Táto náplň je hlavnou časťou, kde prebieha chemiluminiscenčná reakcia s biologickou vzorkou 3. Odberový tampón 4. Mobilná aplikácia, ktorá vyhodnocuje vzorku Integrovaná kamera s bleskom v smartfóne dokáže veľmi šetrne rozpoznať tieto nanočastice (nie je ešte úplne jasné, aký typ vzorky sa bude používať – pravdepodobne vzorka slín, pretože nosohltanový ster je veľmi zložitý úkon vyžadujúci zdravotníckeho špecialistu). Tento originálny imunotest sa vyznačuje veľmi vysokou senzitivitou a špecificitou. S použitím špeciálnych nanomateriálov mechanizmom „lateral flow“ dosahuje 100 – 1000-násobne nižšie limity detekcie, ako je to u tradičných rýchlotestov. Spoločnosť Luminostics garantuje, že táto inovatívna metóda je schopná detegovať baktérie s koncentráciou 100 až 1000 buniek na mililiter a stanovovať agensy v biologických vzorkách vo femtomolárnych (10^-15) množstvách.¹⁰ Cieľom tejto originálnej spolupráce je vývoj nepriamej diagnostickej metódy pre testovanie SARS-CoV-2 s použitím mobilného telefónu. Šlo by vôbec o prvý spotrebiteľský test vo voľnom predaji. Očakáva sa, že výsledok testu by mohol byť dostupný cca o 30 minút. Sanofi a Luminostics plánujú možnosť diagnostiky SARS-CoV-2 pre všetkých užívateľov mobilných telefónov. Aplikácia bude kompatibilná s iOS a Android operačnými systémami. Rýchlo fungujúci domáci test ponúka niekoľko výhod, medzi ktoré môžeme zaradiť ľahkú dostupnosť, vylúčenie osobného kontaktu a zníženie prenosu infekcie pre pacientov a zdravotnícky personál, rýchlosť analýzy a tiež finančnú dostupnosť. Ak vývoj a regulačné povolenia prebehnú úspešne, prvotné odhady zavedenia na trh sú do konca roka 2020.   Literatúra  

1. https://www.who.int/news-room/commentaries/detail/advice-on-the-use-of-point-of-care-immunodiagnostic-tests-for-covid-19
2. http://www.diazyme.com/covid-19-antibody-tests
3. https://www.korona.gov.sk/poziadat-o-vysetrenie-na-covid-19/
4. https://koronavirus.mzcr.cz/seznam-odberovych-center/
5. https://www.sukl.sk/hlavna-stranka/slovenska-verzia/media/tlacove-spravy/aktualizovane-odporucenie-statneho-ustavu-pre-kontrolu-lieciv-ksamotestom-na-covid-19?page_id=5338
6. https://www.clinisciences.com/
7. Kvetková, Janka., https://olup-prednahora.sk/aktuality/blog/laboratorne-testovanie-covid-19-co-nam-prezradia-testy/
8. https://www.sav.sk/index.php?lang=sk&doc=services-news&source_no=20&news_no=8771
9. https://med.stanford.edu/news/all-news/2020/04/smart-toilet-monitors-for-signs-of-disease.html
10. www.luminostics.com